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本试剂盒适用于从各种酵母样品中提取线粒体膜蛋白。提取过程简单方便。本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解线粒体膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒不能用于冷冻样品的线粒体膜蛋白提取。本试剂盒提取的蛋白样本不含有盐成分，可直接用于等电聚焦、2D电泳，如需要用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验，请使用我公司其他货号的试剂盒（HR8067）。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

• 酵母培养物，在4℃，5000×g条件下离心5～10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。
  
• 用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  
• 每100μL体积酵母沉淀物中加入400μL酵母线粒体提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。
  注：酵母数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
  
• 5000×g条件下离心5～10分钟，收集酵母沉淀。
  
• 用PBS洗涤酵母一次，离心收集菌体。
  
• 酵母沉淀物中加入500μL酵母线粒体提取液B，混匀后，在37℃或室温条件下轻微振荡45～120分钟。
  注：一般1小时左右即可。
  
• 在5000×g条件下离心5～10分钟，收集沉淀，弃上清。
  
• 沉淀用PBS洗涤两次。离心收集沉淀。
  
• 沉淀中加入500μL酵母线粒体提取液C，充分混匀，然后在振荡器上轻轻振荡20～40分钟。
  注：此步处理后，沉淀量应减少，如果没有明显减少，需要延长振荡时间。
  
• 高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，500×g条件下离心3分钟。
  
• 将上清吸入另一干净离心管，收集上清，弃沉淀。
  
• 在4℃，11000×g条件下离心20分钟。
  
• 弃上清，在沉淀中加入200～400μL冷的线粒体膜蛋白提取液D，混匀。
  
• 在4℃条件下轻轻振荡20～30分钟。
  注：此步振荡完离心后，沉淀应明显大量减少，否则请延长冰浴裂解时间至30分钟或更长，直至线粒体充分裂解。
  
• 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
  
• 将上清吸入另一干净离心管，37℃水浴5～10分钟，37℃下1000×g～2000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白约为20～50μL。
  注：没用37℃离心条件可以不离心，延长水浴时间至液体澄清透明，分层即可。
  
• 小心移除上层，留下下层即为线粒体膜蛋白。
  
• 用50～100μL膜蛋白溶解液E溶解下层，即得到酵母线粒体膜蛋白样品。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  酵母线粒体膜蛋白丰度极低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大酵母细胞的上样量。
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂BCD的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂E中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。